文章标题：
骨髓细胞中LC3相关的吞噬作用促进肿瘤免疫耐受
出版：细胞2018.10
通讯作者单位：圣犹达儿童研究医院
介绍
大隅良典因发现自噬机制而获得诺贝尔生理学奖，使自噬研究成为热门话题。 自噬被认为是一个重要的细胞过程。 顾名思义，细胞通过“吃掉自身的某些成分”来维持自身的稳态和生存。 当细胞面临营养缺乏等压力环境时，细胞依靠它来维持体内平衡。 重要机制。
我查了一些关于自噬的资料：一般来说，自噬可以分为宏自噬（或者通常意义上的自噬）和一些杂乱类型的自噬。 根据下图，自噬有几个部分：
mTOR 等外周信号通路的调节
ULK1-Atg13-FIP200 复合物的形成
PI3K III 类复合物的组装
Atg5-Atg12-Atg16L1 复合物形成、LC3 裂解和脂化为 LC3-II 以及在囊泡膜上组装的准备
以上两种物质、气泡膜和相应的Cargo最终形成自噬体。
吞噬体和溶酶体融合，Cargo 最终被降解
以上图片信息来自CST公司挂图，详情请点击此处
这是另一张漂亮的图，里面也讲了上面的过程。
国家癌症杂志 2017 年 Sep17(9):528-542
可见自噬中的标志蛋白为LC3、LC3-I、LC3-II。 不过，今天发表的论文并不是关于上面提到的经典自噬过程，而是关于LC3相关的吞噬作用，简称LAP。
显然，至少LAP利用了LC3这种在自噬中发挥很大作用的蛋白质，使吞噬作用成为“自噬”； 但它毕竟不是经典的自噬，如ULK1-Atg13-FIP200等。它可以起作用，但LAP需要Beclin-1（BECN1）和缺乏ATG14但包含Rubicon（RUBCN）等的VPS34起始复合物。
有趣的是，这些异同并不都是“文献综述得来的”——很多都是作者自己做的：作者的前期研究非常深刻。 他们利用基因敲除小鼠（主要是cre-lox技术，影响单核细胞、巨噬细胞、CD11b+ DC）发现：
Beclin-1 (BECN1)、VPS34、ATG5、ATG7、ATG16L1 敲除小鼠失去自噬和 LAP； FIP200、ULK1 或 ATG14 敲除小鼠失去自噬，但出现 LAP； Rubicon (RUBCN) 或 NOX2 敲除小鼠 仍有自噬但无 LAP
（是的，你没看错，这个人差点打造了一支转基因小鼠大军；他沿着上图的自噬途径，基本上发现了LAP和自噬的异同）。 至于为什么LAP需要从自噬的相关机制中“走后门”和“借用”，似乎是因为它可以更好地吞噬和“消化”被吞咽的物质，避免引起免疫反应。
毕竟LAP就是LA的P，P代表吞噬作用。 一般来说，细胞是难以吞咽的，而吞噬作用让人想到免疫细胞。 文献，包括作者自己之前的研究，表明LAP对于吞噬细胞（例如巨噬细胞）非常重要。 那么很自然地想到，肿瘤中吞噬细胞的LAP在肿瘤的发生、发展中是否发挥着重要作用呢？ 目前还没有研究，这是本文的方向。
图1 抑制LAP（但不是经典自噬）可以抑制肿瘤的发生和进展
这里作者敲掉一堆基因只是为了说明一件事：LAP对肿瘤的发生发展影响很大，但经典自噬途径的有无对肿瘤的发生发展没有明显影响； 抑制LAP可以抑制肿瘤的发生、发展。 一些被敲除的基因对于 LAP 很重要，但对于经典自噬并不重要，有些基因则相反。 研究发现，敲除对LAP重要的基因（Becn1、Atg7、Atg16L1、Rubcn等）后，肿瘤的恶性程度显着降低； 只有对经典自噬非常重要的基因被敲除时，才没有变化（为了严谨起见，作者在补充材料中解释道：敲除经典自噬途径的人，都测出了自噬的指标p62，以确认这种敲除方法确实正在影响自噬）。 肿瘤模型为黑色素瘤和肺癌（细胞注射肿瘤模型）
上面用的是肿瘤移植模型，下面用的是诱导肿瘤模型（图D为流程）。 可以看到，作者只针对LAP的关键基因Rubcn，基于骨髓移植替换了小鼠的相关免疫细胞，并利用cre-loxp技术对kars和p53进行修饰，形成肿瘤（这里的Cre表达为腺病毒，而腺病毒是通过呼吸道吸入的病毒，某种程度上可以理解为肺癌）。 EFG 图说明了两组之间肿瘤生长的差异。 Rubcn敲除组肿瘤发生发展受到显着抑制，提示抑制LAP可以抑制肿瘤发生发展，这与上述模型相互验证。
图2LAP调节肿瘤浸润巨噬细胞向M2的极化
图 1 显示 LAP 的存在与肿瘤是否生长之间存在联系，图 2 必须显示这种联系。 作者选择了一个非常传统的想法：肿瘤浸润巨噬细胞（TAM）。 TAM源自骨髓源性抑制细胞（MDSC），因此作者决定先测试TAM的“前体”，却发现肿瘤浸润的CD11b+髓系细胞和两种重要的MDSC（Mo-和PMN-）占总数CD45+ 细胞比例没有差异。
（这里有一个像样的第三方机构写的关于TAM的微信推文，给不懂这部分的同学）
另外：BECN1和ATG5是自噬和LAP共同的“上游”； FIP200只是自噬的“上游”； RUBCN只是LAP的“上游”。
来源没有区别，下一步作者将重点关注功能属性（M1/M2）。 TAM 的功能很复杂，甚至是矛盾的。 它们一般可分为两种类型：M1和M2，分别为促炎型（表达标记为CD86）和抗炎型（标记为CD206）。 作者测量了TAM及其主要前体Mo-MDSC，如图D和E所示，发现LAP途径受损后（而不仅仅是经典自噬受损），TAM的CD86表达水平较高，而CD86表达水平较低CD206 的 M1 比 M2 的可能性更大。 使用Fig1D中介绍的模型对F~I进行了验证，得到了一致的结论，不再赘述。这组图表明，LAP通过调节TAM向抗炎和抗肿瘤方向的极化来促进肿瘤生长。促癌M2亚型。
图3 单细胞测序技术辅助论证，进一步靶向I型IFN通路
格林博士和他的圣裘德儿童医院都是最前沿的。 本文采用了先进的组学分析技术——单细胞测序（scRNA-seq）。
有兴趣了解scRNA-seq的同学可以参考以下综述：单细胞RNA测序用于发育、生理学和疾病的研究。 Nat Rev Nephrol.2018 年 5 月 22 日。
单细胞RNA测序，顾名思义，是单细胞水平的转录组分析。 我们不需要了解具体测序技术的复杂性； scRNAseq的下游分析方法有多种，本文采用scRNAseq常规的下游分析方案——无监督聚类分析。 聚类方面，这里采用了比较高端的t-SNE算法。
词聚类很容易理解，分类即可； 无监督这个词有点数学化。 简而言之，就是让算法在没有人类“指导”的情况下，自行发现数据的特征并进行分类。 无监督聚类分析属于机器学习，目前有很多解决方案，例如众所周知的层次聚类和K-means聚类，以及本文使用的t-SNE算法。 这是一条关于该算法的推文，介绍了其数学原理。 有理工科背景的同学可以看一下。
作者对来自 Rubcn+/- 和 -/- 的肿瘤浸润骨髓细胞进行了测序。 如上图A所示，根据每个细胞的表达谱特征，t-SNE算法对数以万计的基因表达矩阵进行“压缩”和提取特征，最终将其绘制在二维坐标图上，并自动对它们进行分类，得到上述图B的分类结果。
由于是无监督聚类，得到的细胞群具有相似的表达谱特征，但不一定具有明确的生物学意义，因此有必要探究这些细胞群到底是什么。 作者捕获了巨噬细胞关键标志物（F4/80、Ly-6C、MHC-II）的表达来解读这7个簇的细胞类型，如下表所示：簇1和2可以认为是单核； 3,4,5,6,7可以认为是成熟的TAM，其中3,4,5 MHC-II表达量较高，6,7 MHC-II表达量相对较低（实际上有一些无法解释的簇，作者未包含在此）。
结合图DE，对于具有高MHC-II表达的成熟TAM（簇3、4、5），具有更多Rubcn+/-细胞的簇3、4比具有更多-/-细胞的簇5具有更强的M2类型。 巨噬细胞标记物的表达证实了图2中得出的观点，即LAP促进TAM向M2的极化（我个人认为这个分析有道理，但看起来很荒谬......）
图F显示了这七个簇中I型IFN靶基因表达的热图。 竖条是基因，横条根据七个簇的主要细胞来源分为两组（Rubcn+/-和-/-）。 ，颜色深度代表该簇中该基因呈阳性的细胞的百分比。 可以发现，Cluster 2和Cluster 5在Rubcn-/-组中强表达，Cluster 5是高表达MHC-II的成熟TAM。 这表明Rubcn缺失（或LAP限制）可能促进TAM中的Ⅰ型。 干扰素途径。 G选择了cluster5中前100个特异表达的基因，进行了pathway分析（但真不知道这100个基因是怎么筛选出来的），得到了类似的Ⅰ型IFN途径的富集。 图H显示了所选的三个I型IFN靶基因的qPCR验证。 这组图表明IFN途径是LAP影响TAM的重要途径。
图4 通过LAP途径吞噬肿瘤细胞的TAM往往表现出抗炎和促癌表型
文献指出，肿瘤免疫耐受的重要原因之一是巨噬细胞在吞噬垂死的肿瘤细胞后并不举旗，而是释放“被动回避”信号。 作者之前的研究证实，如果LAP出现问题，巨噬细胞在吞噬细胞碎片后会“消化”，产生更多的炎症介质。 该文章指出，髓系细胞（尤其是TAM）中LAP的存在与否影响着肿瘤的发生和发展。 这让人们推测TAM通过LAP吞噬垂死的肿瘤细胞可能是它们在肿瘤中“同谋”的原因； 阻断 TAM 中的“正常”LAP 会导致被吞噬的肿瘤细胞碎片“消化不良”。 相反，它刺激了TAM，这就像将TAM从“温柔的国家”中拉出来，让它们“认清敌情”，发挥抗肿瘤作用。 我个人认为，上述猜想是本文的核心科学假设。
眼见为实。 作者首先设计了所谓的 LLC mCherry-spectrin 细胞，这是一种细胞骨架蛋白上附着有紫色荧光基团的肿瘤细胞。 作者将上述细胞移植到GFP（绿色荧光蛋白）标记的LC3小鼠体内，取肿瘤切片进行免疫荧光和共聚焦，最终得到如图A所示的结果（下图为放大图）：细胞背景为CD11b (TAM)，囊泡内部是紫红色的肿瘤细胞碎片，外面的绿色环是LC3。 这种囊泡结构就是最经典的LAP吞噬泡应该有的样子。
图B：作者从Rubcn+/+和-/-两组中分选了mCherry+（即被吞噬的肿瘤细胞）TAM，并使用qPCR测量了多个I型IFN靶基因的表达。 正如预期的那样，LAP缺陷组中的TAMs有更高的表达水平，这与图3的结论一致。
作者通过体外实验进一步证明了这一点。 这里使用的是一种常用的巨噬细胞功能体外实验方法——骨髓源性巨噬细胞（BMDM）。 作者从Rubcn+/+和-/-组收集BMDM并刺激凋亡细胞。 首先，他们进行 RNAseq 以观察差异表达（图 C）。 结果发现，Rubcn-/-组上调的基因中，有很多促炎基因和I型IFN靶基因。 当然，作者还进行了pathway富集分析，这包含在补充材料中。
图D显示了M2标记CD206的表达，结果相似：没有东西可以吞咽时，LAP限制似乎没有作用； 但在“喂养”凋亡细胞后，LAP不限制组变得“更M2”。 上述结果初步证实了作者的猜想，即LAP对于巨噬细胞吞噬死亡肿瘤细胞后表现出免疫抑制表型非常重要。
下一步就是寻找上游和下游。 据文献报道，TIM-4是巨噬细胞有效吞噬濒死细胞的重要开关分子，也是LAP的重要开关。 作者不仅有各种自噬途径基因敲除小鼠，还有TIM-4敲除小鼠……于是他做了图E和F，展示了敲除TIM-4后肿瘤细胞的能力和吞噬能力。 肿瘤细胞中巨噬细胞LC3的表达显着降低，证实了文献中的观点。 图G和H是体内荷瘤实验，也证明了TIM-4对肿瘤发生发展的促进作用。 图I显示同时敲除TIM-4和Rubcn没有加和效应，表明TIM-4和Rubcn处于同一途径，即LAP。
图5 巨噬细胞通过LAP吞噬肿瘤细胞抑制STING激活介导的IFN上调
既然上面的文章花了很多钱把故事引向IFN，那么我们应该探讨一下IFN在LAP干预肿瘤免疫相关通路中的作用。 图A和B显示，敲除Atg5和Atg7这两个对经典自噬和LAP很重要的基因可以抑制肿瘤生长； 然而，敲除IFN受体却没有效果，这表明IFN途径是LAP影响肿瘤免疫的重要下游途径。 这也与单细胞测序等得到的结论一致。
图C~E从IFN的上游开始。 文献表明，除非肿瘤细胞被吞噬作用吞噬，否则它们的DNA可以通过细胞质DNA传感器STING诱导IFN途径。 作者发现，当用肿瘤细胞DNA刺激来自Rubcn+/+和-/-组的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）时，两组间IFN的表达相似； 然而，当用凋亡细胞刺激时，只有Rubcn-/-组表现出IFN上调； 敲除STING（基因名为Tmem173）后，Rubcn-/-组未见明显的IFN上调。 上述结果提示，肿瘤细胞DNA刺激后IFN的上调依赖于“受体”STING，但LAP“隔离”了这种刺激，从而避免了STING途径的激活，抑制了肿瘤细胞DNA刺激后IFN的上调。肿瘤细胞的吞噬作用。
图F、G、H、I和J均为体内荷瘤实验。 研究发现，敲除STING后，LAP缺陷对肿瘤发展具有抑制作用，并且抑制TAM在M2方向的极化。 被取消了。 这从体内角度论证了上述观点，即STING-IFN是LAP调节肿瘤免疫的重要下游。
图6 抑制LAP可通过STING诱导IFN表达并促进肿瘤浸润CD8+ T细胞的活化
在阐明了有或没有LAP时TAM的变化后，作者最后把目光聚焦在肿瘤免疫微环境战场上的前线战士：肿瘤浸润的CD4/8+ T淋巴细胞（这个想法也很常见，比如这篇文章就是这样的）我们发布的内容已展开）。
图AB显示，敲除LAP和经典自噬共同上游Atg7，或仅敲除LAP上游Rubcn，但不敲除仅经典自噬上游Fip200，可使肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞表达更多 IFNγ。 但它并不影响浸润细胞的净数量（图EF）。 图C和D显示了对CD4+T细胞的类似分析并获得了类似的结果。 即LAP缺陷可促进CD4+/CD8+T细胞活化和IFNγ表达。 另外，还有两个细节：肿瘤浸润T细胞中Treg的比例和耗尽T细胞的比例没有显着差异。
为了证实CD4+/8+ T细胞的激活和IFN表达是LAP缺陷介导的肿瘤免疫活跃的原因，作者使用抗CD4/抗CD8抗体来消耗CD4+和CD8+ T细胞，发现表明经过这样的手术后，LAP缺陷所导致的肿瘤免疫激活和肿瘤生长抑制被消除（图H、I）。 这一发现证明髓系细胞中LAP的存在与否并不直接影响肿瘤的生长，而是需要通过影响肿瘤浸润T细胞的活化来发挥其作用。
最后，作者需要澄清上面发现的下游是否可以与这里的T细胞表型联系起来，即TAM中在LAP影响下的STING-IFN通路是否是导致T细胞IFN-γ表达差异的原因。这里是肿瘤浸润T细胞。 事实上，文献已经指出STING依赖的I型IFN产生可以诱导抗肿瘤T细胞反应，所以这里的证明并没有迈出大的一步。 图J指出，IFN通路的完整性对于LAP限制引起的肿瘤浸润CD8+T细胞（表达IFNγ）的激活非常重要； 图K、L和M指出STING通路的完整性对于LAP限制引起的肿瘤浸润CD8+很重要。 +T细胞激活（IFNγ表达）具有重要意义。 这表明髓系细胞中LAP的损伤会促进STING-IFN通路，从而促进CD8+T细胞的激活。
至此，全文就完成了。 作者利用复杂但清晰的各种基因敲除小鼠，有效地人为调控了自噬和LAP这两个亚细胞且略为抽象的生物过程，使深入研究LAP成为可能。 这篇文章最明显的问题是，最精密的基因敲除只能实现“髓系”的选择性敲除，但实际上作者关心的是巨噬细胞，它们之间还是有很多差异的。 不得不说，这篇文章对于我这样缺乏相关领域基础知识的本科生来说确实很难理解。 LAP、经典自噬、肿瘤微环境、单细胞测序等都比较陌生。 如有错误或遗漏，敬请原谅并指正。
下图是这篇文章的图文摘要，大致讲述了以下故事：
在 LAP 存在的情况下，垂死的肿瘤细胞在肿瘤浸润巨噬细胞 (TAM) 表面的 TIM-4 分子的帮助下被 TAM 吞噬，并通过 LC3 介导的吞噬作用被“消化”(即 LAP)。 当由于TIM-4受损或LAP相关通路受损而无法发生LAP时，被TAM吞噬的垂死肿瘤细胞可能“消化不良”，导致TAM表现出M1（促炎和抑癌）表型，并且STING刺激I型IFN的表达，促进肿瘤微环境中的T淋巴细胞（如CD8+T淋巴细胞）发挥抗癌作用。
通讯作者信息
道格拉斯·格林 (Douglas R. Green) 是一位非常成功的学者，拥有许多高被引用的论文和学术奖项。 他的研究兴趣是癌症和免疫系统中的细胞凋亡机制。 Green 博士最近似乎参与了 LAP。 除了上面提到的基因敲除小鼠大军之外，他在2017年发表了一篇综述PMC5743439，有兴趣的同学可以看一下； 2018年，他出版了这部《Cell》杰作。
物以类聚，物以类聚。 格林医生工作的医院是著名的圣裘德儿童研究医院。 这家医院成立于1962年，由著名演员丹尼·托马斯捐赠。 它位于田纳西州孟菲斯。 它是美国最好的儿童医院之一，其儿童肿瘤尤其是血液肿瘤的诊治水平位居全美第一。 正如其名称中的“研”字一样，这家医院特别注重科学研究，以发现新知识、开发新疗法、通过科技创新拯救更多生命为己任。 其整体科研实力享誉世界。 该医院是一家研究型医院，专门治疗儿童恶性肿瘤和其他恶性疾病。 是一所公益性医院，靠社会捐赠和政府免税政策运营。 它不向儿童收取任何费用。 高度重视科学研究，大力投入科研经费，为人才提供优厚的待遇。 医院的座右铭是寻找治疗方法，拯救儿童。 这句话印在医院的每一位白大褂上，我想也印在圣裘德医院每一位医疗科技工作者的心中。 我希望所有热爱生命科学研究的南京医学生都有机会在这样的地方从事像本文这样的研究； 我也衷心希望我们南京医科大学能够发展成这样一个好地方。
*本文来自我校第一附属医院推荐
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